Список веществ по алфовитy а б в г д е ж з и к л м н п р с т у ф х ц ч ш э ю я

Нуклеиновые кислоты

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ (полинуклеотиды), биополимеры, осуществляющие хранение и передачу генетич. инфор-мации во всех живых организмах, а также участвующие в биосинтезе белков.

Первичная структура нуклеиновых кислот представляет собой последовательность остатков нуклеотидов. Последние в молекуле нуклеиновых кислотобразуют неразветвленные цепи. В зависимости от природы углеводного остатка в нуклеотиде (D-дезоксирибозы или D-рибозы) нуклеиновые кислотыподразделяют соотв. на дезоксирйбонуклеи-новые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК) к-ты. В молекуле ДНК гетероциклы, входящие в остаток нуклеотида, представлены двумя пуриновыми основаниями - адeнином (А) и гуанином (G), и двумя пиримидиновыми основаниями -тими-ком (Т) и цитозином (С); РНКвместо Т содержит урацил (U). Кроме того, в нуклеиновых кислотах в небольших кол-вах обнаруживаются модифицированные (в осн. метилированные) остатки нуклеозидов- т. наз. минорные нуклеозиды, к-рыми особенно богаты транспортные рибонуклеиновые кислоты (тРНК). Отдельные нуклеотидные остатки связаны между собой в полинуклеотидных цепях 3-5-фосфодиэфирными связями (см. ф-лу). Стандартная запись нуклеотидной последовательности осуществляется в направлении от 5-конца к 3-концу (каждый нуклеотид обозначают буквой, присвоенной основанию, к-рое он содержит; напр., последовательность приведенного участка ДНК записывается как ACGT).


3058-13.jpg

Св-ва ДНК и РНК различны. Так, РНК легко расщепляется щелочами до мононуклеотидов (благодаря наличию группы 2-ОН), в то время как полинуклеотидные цепи ДНК в тех же условиях стабильны. Это структурное различие определяет и меньшую устойчивость к воздействию к-т N-гликозидных связей (связь между гетероциклом и остатком рибозы) в ДНК по сравнению с РНК.

Дсзоксирибонуклепновые кислоты. Нуклеотидный состав ДНК подчиняется ряду правил (т.наз. п р а в и л а Ч а р г а ф-ф а), важнейшее среди к-рых-одинаковое содержание А и Т, G и С у любой клеточной ДНК. Нуклеотидный состав РНК подобным правилам не подчиняется.

Пространствю структура ДНК описывается как комплекс двух полинуклеотидных антипараллельных цепей (рис. 1), закрученных относительно общей оси, так что углевод-фосфатные цепи составляют периферию молекулы, а азотсодержащие гетероциклы направлены внутрь (д в о й н а я с п и р а л ь У о т с о н а-К р и к а). Антипараллельность полинуклеотидных цепей выражается в том, что на одном и том же конце спирали одна полинуклеотидиая цепь содержит (незамещенную или замещенную) группу 5-ОН, а другая 3-ОН. Фундам. св-во двойной спирали ДНК состоит в том, что ее цепи комплементарны друг другу (см. Комплемен-тарностъ)вследствие того, что напротив А одной цепи всегда находится Т другой цепи, а напротив G всегда находится С. Комплементарное спаривание А с Т и G с С осуществляется посредством водородных связей. Классич. двойная спираль Уотсона-Крика получила назв. В-формы ДНК. Она-правозакрученная, плоскости гетероциклич. оснований перпендикулярны оси спирали, а число пар остатковнуклеотидов на один виток спирали равно примерно 10; расстояние между витками 3,4 нм. При изменении ионной силы и состава р-рителя двойная спираль изменяет свою форму и даже может превращ. в левозакрученную спираль (т.наз. Z-форму), к-рая содержит в одном витке ок. 12 остатковнуклеотидов. При дегидратации В-формы образуется А-форма ДНК-правозакрученная двойная спираль, содержащая в одном витке ок. 11 остатковнуклеотидов, плоскости гетероциклич. оснований повернуты примерно на 20° относительно перпендикуляра к оси спирали. Двойная спираль ДНК способна денатурировать (напр., при повышении т-ры) с полным расхождением комплементарных цепей, к-рые сохраняют способность к ассоциации с восстановлением (рекатурацией) двойной спирали при возвращении к исходным условиям. Подробно изучены также кон-формации фрагментов ДНК.

3058-14.jpg

 

Рис. 1. Двойная спираль ДНК (стрелками показано направление полинуклеотидной цепи). .



Установлено, чго молекула ДНК в клетке представляет собой совокупность генов, регуляторных участков (последовательностей, связывающихся срегуляторными белками и управляющих уровнем экспрессии генов), районов, участвующих в организации генов в хромосомах, а также последовательностей, ф-ции к-рых еще не известны.

У прокариот (бактерии и синезеленые водоросли) ДНК организована в виде компактного образования-н у к л е о и-д а, к-рый содержит всю хромосомнуюДНК клетки длиной в неск. миллионов пар нуклеотидов (м.п.н.). Кроме того, у мн. прокариог и эукариот (все организмы, за исключением прокариот) обнаружены ьнехромосомные ДНК (т. наз. плаз-миды)размером от неск. тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) до неск. десятков т.п.н. (м.п.н. и т.п.н.-принятые единицы длины двухцепочечной молекулы нуклеиновых кислот)-

Мн. ДНК образуют кольцевые структуры. В том случае, если обе полинуклеотидные цепи ДНК ковалентно непрерывны, ДНК может находиться в сверхспирализованной (сверхскрученной) форме (рис. 2). В клетках сверхспирализация осуществляется ферментами ДНК-гиразами (топоизомеразами II).

Хромосомные ДНК эукариот локализованы в клеточном ядре, где вместе с гистонами и негистоновыми белками образуют хроматин -ну-клеопротеид, из к-рого организованы хромосомы. Размеры ДНК в отдельных эукариотич. хромосомах колеблются в широких пределах-от 103 до 105 т.п.н.

3058-15.jpg

 

Рис. 2. Сверхспирализация двухцепочечной кольцевой ДНК под действием ДНК-гиразы: 1 - кольцевая форма ДНК; 2 - сверхспирализованная форма ДНК. 


Геномы мн. вирусов бактерий (бактериофагов), животных и в более редких случаях растений представлены ДНК. Такие клеточные органеллы, какмитохондрии и хлоропласты, имеют также свою собственную ДНК размером от неск. десятков до неск. сотен т.п.н.

 

Биосинтез ДНК осуществляется в результате репликации-точного самокопирования (самовоспроизведения) путем синтеза новой молекулы ДНК на исходной ("материнской"), к-рая играет роль матрицы. Этот процесс осуществляется под действием фермента ДНК-полимеразы. Матрицей для синтезаДНК может служить также однотяжевая (одноцепочечная) РНК, комплементарное копирование к-рой осуществляет фермент обратная транскриптаза.

Рибонуклеиновые кислоты. РНК, как правило, построены из одной полинуклеотидной цепи, характерный элемент вторичной структуры к-рой - "шпильки", перемежающиеся однотяжевыми участками (рис. 3). Шпилька - двутяжевая спиральная структура, образующаяся в результате комплементарного спаривания оснований (А с U и G с С). Шпильки и соединяющие их одно-тяжевые участки РНК укладываются в компактную третичнуюструктуру. Для тРНК вторичная структура имеет характерную форму, к-рую наз. "клеверным листом". Известны редкие примеры целиком двухспиральныхмолекул РНК.

Двухспиральные гибридные комплексы (ДНК и РНК) м.б. искусственно получены из комплементарных однотя-жевых ДНК и РНК. ФункциональноактивныеРНК имеют размер от 70-150 до неск. тысяч нуклеотидных остатков. Биосинтез РНК (транскрипция)обычно происходит в результате комплементарного копирования ДНК-матрицы, к-рое осуществляет фермент РНК-полимераза.

Известно неск. типов РНК. Рибосомные рибонуклеиновые кислоты, связываясь с рибосомными белками, образуют рибосомы, в к-рых осуществляетсясинтез белка. Матричные рибонуклеиновые кислоты служат матрицами для синтеза белков (трансляции). тРНК осуществляют связывание соответствующей аминокислоты и ее перенос к рибосомам. Обнаружены т.наз. малые ядерные РНК, участвующие в превращ. первичных продуктовтранскрипции в функционирующие молекулы; т.наз. антисмысловые РНК участвуют в регуляции биосинтеза белка и репликации плазмидных ДНК. В видеРНК представлены геномы мн. вирусов (РНК-содержащие вирусы), в к-рых матрицами для синтеза РНК служат вирусные РНК. Нек-рые РНК обладают ферментативной активностью, катализируя расщепление и образование фосфодиэфирных связей в своих собственных или др. молекулах РНК.

Определение первичной структуры (секвенирование) нуклеиновыхкислот. Секвенирование нуклеиновых кислот позволяет определить в одном эксперименте последовательность нуклеотидов в ДНК или РНК, содержащих неск. сотен мономерных звеньев. Методы основаны на общем принципе - определении с помощью высоко-разрешающего электрофореза в полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотида длины всех возможных фрагментов секвенируемого участка нуклеиновой кислоты, содержащих на одном конце одну и ту же последовательность нуклеотидов (гомогенный фрагмент), а на другом-один и тот же нуклео-тид. Такие фрагменты получают двумя разл. способами. В первом случае (метод Максама-Гилберта) гомогенный фрагмент ДНК или РНК, предварительно меченный радиоактивной меткой по одному из концов, расщепляют хим. агентами, специфичными к одному из четырех нуклеотидных остатков (A, G, С, Т или U); в случае РНК этот процесс осуществляют также специфич. рибонуклеазами. Расщепление ведут в таких ограничивающих условиях, когда в каждой молекуле нуклеиновой кислоты расщепляется только одна меж-нуклеотидная связь рядом снуклеотидом данного типа, независимо от его положения в цепи. Такую операцию проводят для каждого из четырех нуклеотидных остатков и по длинам образующихся радиоактивных фрагментов определяют положение каждого нуклеотида в цепи нуклеиновой кислоты.

3058-16.jpg


В др. случае (м е т о д С е н г е р а) используют олиго- или полинуклеотидную затравку (праймер) известной длины, коплементарную определенному участку нуклеиновой кислоты. Затравку наращивают с помощью ДНК-полимеразы, останавливая синтез на одном из четырех типов нуклеотидных остатков с равной вероятностью, независимо от его положения в цепи. Для этого к смеси четырех прир. субстратов ДНК-полимеразы добавляют т.наз. терминатор (обычно 2, 3-ди-дезоксинуклеозидтрифосфат) - аналог определяемого нукле-отидного остатка, попадание к-рого на 3-конец растущей цепи останавливает синтез. При этом радиоактивная метка вводится либо в затравку, либо в субстрат. Операцию повторяют для каждого из четырех нуклеотидов; длину образующихся радиоактивных фрагментов определяют стандартным способом. Эти методы в настоящее время удалось полностью автоматизировать (заменив в ряде случаев радиоактивную метку на флуоресцентную) и тем самым в тысячи раз повысить скорость секвенирования ДНК.

Получение нуклеиновых кислот. В клетках нуклеиновые кислоты связаны с белками, образуя нуклеопротеиды. Выделение нуклеиновых кислотсводится преим. к очистке их от белков. Для этого препараты, содержащие нуклеиновые кислоты, обрабатывают ПАВ и экстрагируют белки фенолом. Послед, очистка и фракционирование нуклеиновых кислот проводятся с помощью ультрацентрифугирования, разл. видов жидкостной хрома-тографии и гель-электрофореза. Для получения индивидуальных нуклеиновых кислот обычно используют разл. варианты последнего метода.

Совр. методы хим. синтеза нуклеиновых кислот позволяют получать крупные фрагменты ДНК, в т.ч. целые гены. Методич. основы хим.-ферментативных методов синтеза ДНК разработаны X. Кораной. Они включают: 1) хим. синтез комплементарных, взаимоперекрывающихся олигонукле-отидов, из к-рых затем в результате комплементационных взаимод. выстраиваются дуплексы - фрагменты молекулы синтезируемой ДНК с несовпадающими разрывами в обеих цепях; 2) соединение (лигирование) таких олигонуклеотидов в составе дуплекса с помощью фермента Т4 ДНК-лигазы. Сборку протяженных ДНК из синтетич. однотяжевых олигонуклеотидов проводят в неск. этапов (рис. 4). Сначала (а) собирают небольшие дуплексы с "липкими" концами (одно-тяжевыми комплементарными участками), из к-рых затем последовательно (б, в и т. д.) формируют более протяженные структуры. Т. обр. могут быть получены искусств. фрагменты ДНК большой длины и с любой нуклеотидной последовательностью. С помощью генетич. инженерии возможноклонирование (получение в индивидуальном виде и размножение) искусств. ДНК.

3058-17.jpg

Рис.4. Схема синтеза полидезоксинуклеотида: 1,- соотв. 5- и 3-конец олигонуклеотидов; 3-комплементарные участки концов дуплексов(:липкие: концы); а,б и в-стадии образования дуплексов (все стадии катализируются Т4 ДНК-лигазой).

Синтез олигодезоксинуклеотидов Корана осуществил т. наз. фосфодиэфирным методом по схеме:

3058-18.jpg

К динуклеотиду со своб. 3-гидроксильной группой присоединяют таким же способом динуклеотид с незащищенной 5-фосфатной группой и т.д. (т.наз. блочный метод синтеза):

3058-19.jpg

Несмотря на малую эффективность этого метода, были синтезированы олигонуклеотиды, содержащие до 16 звеньев, из к-рых были собраны первые синтетич. гены. Фосфоди-эфирный метод образования межнуклеотидных связей, использованный Кораной, имеет история, значение. Однако разработанные им приемы введения и избират. удаления защитных групп широко используются в др. методах синтеза нуклеиновых кислот.

Важным шагом в совершенствовании синтеза олигонукле-отидов явилась разработка т.наз. фосфотриэфирного метода, к-рый осуществляют по схеме:

3059-1.jpg

Образующийся динуклеотид далее (после частичного деблокирования фосфата) конденсируют аналогичным образом с др. динуклеотидом и т.д. Применение этого способа, в к-ром используют защиту фосфатной группы, позволило значит. сократить время синтеза и повысить выходы олиго-нуклеотидов.

Параллельно этим методам, к-рые осуществляют в р-рах, разрабатывались твердофазные способы синтеза нуклеиновых кислот. В последнем случае процесс проводят в двухфазной системе; нуклеозидный компонент связан ковалентно с нерастворимым полимером, а нуклеотидный компонент и необходимые реагенты находятся в р-ре.

Обычно в этом случае на первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью "якорной" группы к нерастворимому полимеру. Затем его 5-гидроксильную группу деблокируют и конденсируют с нуклеотидным компонентом. У образующегося полностью защищенного динуклеозидмонофосфата деблокируютзащитную группу в положении 5 и присоединяют след. нуклеотид и т.д.

Наиб. распространенные методы твердофазного синтеза олигонуклеотидов основаны на использовании нуклеотидного компонента, содержащего Р(III). В т.наз. амидофосфитном-способе (рис. 5) нуклеотидным компонентом является эфир 3-амидофосфита дезоксинуклеозида. Достаточно устойчивыеамидофосфиты при протонировании в присут. тетразола превращ. в сильные фосфорилирующие агенты. Схема также включает блокирование непрореагировавшей 3-гидроксигруппы достраивающегося олигонуклеотида (кэпирование) и окисление межнуклеотидного фосфита. На рис. показан один цикл наращивания цепи, к-рый длится 5-7 мин и далее повторяется. После завершения синтеза удаляют защитные группы с межнуклеотидных фосфатов, отделяют олигонуклеотид от носителя, деблокируют группы NH2 гетероциклов. Липофильную группу (МеО)2Тr удаляют после первого хроматографич. разделения.

3059-2.jpg

 

Рис. 5. Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов амидофосфитным методом; П - полимерный носитель, Ру- пиридин.



Др. метод основан на использовании гидрофосфориль-ного производного нуклеозида:

3059-3.jpg

П-полимерный носитель

После снятия 5-защитной диметокситритильной группы возможно присоединение след. нуклеотида. Окисление межнуклеотидных фосфитных групп проводят после завершения синтеза олигонуклеотида.

Стандартность операций в твердофазном синтезе олиго-нуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов реагентов и р-рителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленным на нем первым нукле-озидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезир. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода

в автомате-синтезаторе за неск. часов получают 30-40-звен-ные олигонуклеотиды; возможен синтез более чем 100-звен-ных фрагментов ДНК. Разработаны синтезаторы, позволяющие проводить одновременно синтез неск. олигонукле-отидов.

Синтез олигорибонуклеотидов ферментативным путем осуществляют обычно с использованием рибонуклеаз (РНаз) или полинуклеотидфосфорилаз(ПНФаз). В первом случае р-цию осуществляют по схеме:

3059-4.jpg

R-H или остаток олигорибонуклеотида

В качестве нуклеотидного и нуклеозидного компонентов применяют мономеры или олигонуклеотиды. Эту р-цию используют для синтеза ди-, три- и тетрарибонуклеотидов. При увеличении длины олигорибонуклеотида начинает преобладать обратная р-ция (гидролиз олигонуклеотида).

Для синтеза олигорибонуклеотидов с большим числом звеньев используют ПН Фазу:

3059-5.jpg

РР-Остаток пирофосфорной н-ты 

Хим. синтез олигорибонуклеотидов проводят в осн. с использованием тех же приемов, как и при синтезе ДНК. Дополнит. трудности связаны с селективной защитой 2-гидроксигруппы рибозы, а также с неустойчивостью фос-фодиэфирной связи РНК в щелочной среде.

Длинные фрагменты РНК получают из коротких, соединяя их с помощью РНК-лигазы.