Список веществ по алфовитy а б в г д е ж з и к л м н п р с т у ф х ц ч ш э ю я

Белки


БЕЛКИ, высокомол. прир. полимеры, построенные из остатков аминокислот, соединенных амидной (пептидной) связью —СО—NH—. Каждый белок характеризуется специфич. аминокислотной последовательностью и индивидуальной пространств, структурой (конформацией). На долю белков приходится не менее 50% сухой массы орг. соед. животной клетки. Функционирование белков лежит в основе важнейших процессов жизнедеятельности организма. Обмен в-в (пищеварениедыхание и др.), мышечное сокращение, нервная проводимость и жизнь клетки в целом неразрывно связаны с активностью ферментов - высокоспецифич. катализаторов биохим. р-ций, являющихся белками. Основу костной и соединительной тканей, шерсти, роговых образований составляют структурные белки (см., напр., Коллаген). Они же формируют остов клеточных органелл (митохондриймембран и др.). Расхождение хромосом при делении клетки, движение жгутиков, работа мышц животных и человека осуществляются по единому механизму при посредстве белков сократительной системы (см., напр., АктинМиозин). Важную группу составляют регуляторные белки, контролирующие биосинтез белков и нуклеиновых к-т. К регуляторным белкам относятся также пептидно-белковые гормоны, к-рые секретируются эндокриннымижелезами. Информация о состоянии внеш. среды, разл. регуляторные сигналы (в т. ч. гормональные) воспринимаются клеткой с помощью спец. рецепторных белков, располагающихся на наружной пов-сти плазматич. мембраны. Эти белки играют важную роль в передаче нервного возбуждения и в ориентированном движении клетки(хемотаксисе). В активном транспорте ионовлипидовСахаров и аминокислот через биолмембраны участвуют транспортные белки, или белки-переносчики. К последним относятся также гемоглобин и миоглобин, осуществляющие перенос кислорода. Преобразование и утилизация энергии, поступающей в организм с питанием, а также энергии солнечного излучения происходят при участии белков биоэнергетич. системы (напр., родопсинцитохромы). Большое значение имеют пищевые и запасные белки (см., напр., КазеинПроламины), играющие важную роль в развитии и функционировании организмов. Защитные системы высшихорганизмов формируются защитными белками, к к-рым относятся иммуноглобулины (ответственны за иммунитет), белки комплемента (ответственны за лизисчужеродных клеток и активацию иммунологич. ф-ции), белки системы свертывания крови (см., напр., ТромбинФибрин) и противовирусный белок интерферон.

По составу белки делят на простые, состоящие только из аминокислотных остатков, и сложные. Сложные могут включать ионы металла (металлопротеиды) или пигмент(хромопротеиды), образовывать прочные комплексы с липидами (липопротеины), нуклеиновыми к-тами (нуклеопротеиды), а также ковалентно связывать остаток фосфорной к-ты (фосфопротеиды), углевода (гликопротеины)или нуклеиновой к-ты (геномы нек-рых вирусов). В соответствии с формой молекул белки подразделяют на глобулярные и фибриллярные. Молекулы первых свернуты в компактные глобулы сферич. или эллипсоидной формы, молекулы вторых образуют длинные волокна (фибриллы) и высокоасимметричны. Большинство глобулярных белков, в отличие от фибриллярных, растворимы в воде. Особую группу составляют мембранные (амфипатические) белки, характеризующиеся неравномерным распределением гидрофильных и гидрофобных (липофильных) участков в молекуле: погруженная в биол.мембрану часть глобулы состоит преим. из липофильных аминокислотных остатков, а выступающая из мембраны - из гидрофильных.

Историческая справка. Первые работы по выделению и изучению белковых препаратов были выполнены еще в 18 в., однако в тот период исследования белков носили описательный характер. В нач. 19 в. были сделаны первые анализы элементного состава белков (Ж. Л. Гей-Люссак, Л. Ж. Тенар, 1810), положившие начало систематич. аналит. исследованиям, в результате к-рых было установлено, что все белковые в-ва близки не только по внеш. признакам и св-вам, но и по элементному составу. Важное следствие этих работ - создание первой теории строения белковых в-в (Г.Я. Мульдер, 1836), согласно к-рой все белки содержат общий гипотетич. радикал - "протеин", имеющий эмпирич. ф-лу C40H62N10O12 и связанный в разл. пропорциях с атомами серы и фосфора. Получив вначале всеобщее признание, эта теория привлекла интерес к аналит. исследованиям белков, совершенствованию препаративных методов белковой химии. В этот период были разработаны простейшие приемы выделения белков путем экстракции р-рами нейтральных солей и осаждения, получены первые кристаллич. белки (гемоглобин, нек-рые растит. белки), дляанализа белков стали использовать кислотный и щелочной гидролиз.

Создание теории протеина совпало по времени с формированием представлений о функции белков в организме. В 1835 Й.Я. Бёрцедиус высказал идею о важнейшей ф-ции белков - биокаталитической. Вскоре были открыты первые протеолитич. ферменты - пепсин (Т. Шмнн._1836) и трипсин (Л. Корвизар, 1856). Открытие протеазстимулировало интерес биохимиков к физиологии пищеварения, а следовательно, и к продуктам переваривания белков. К сер. 19 в. было показано, что под действием протеолитич. ферментов белки распадаются на близкие по св-вам фрагменты, получившие назв. пептонов (К. Леман, 1850).

Важное событие в изучении белков - выделение из белкового гидролизата аминокислоты глицина (А. Браконно, 1820). К кон. 19 в. было изучено большинствоаминокислот, входящих в состав белков, синтезирован аланин (А. Штреккер, 1850). В 1894 А. Косеелъ высказал идею о том, что осн. структурными элементами белков являются аминокислоты.

В нач. 20 в. значит. вклад в изучение белков был внесен Э. Фишером, .впервые применившим для этого методы орг. химии. Путем встречного синтеза Э. Фишер доказал, что белки построены из остатков1048-1.jpgаминокислот, связанных амидной (пептидной) связью. Он также выполнил первые аминокислотные анализы белков, дал правильное объяснение протеолизу.

В 20-40-е гг. получили развитие физ.-хим. методы анализа белков. Седиментационными и диффузионными методами были определены мол. массы многих белков, получены данные о сферич. форме молекул глобулярных белков (Т. Сведберг, 1926), выполнены первые рентгеноструктурные анализы аминокислот и пептидов (Дж. Д. Бернал, 1931), разработаны хроматографич. методы анализа (А. Мартин, Р. Синг, 1944). Существенно расширились представления о функциональной роли белков: был выделен первый белковый гормон - инсулин (Ф. Бантинг, Ч. Г. Бест, 1922), антитела были идентифицированы как фракция1048-2.jpgглобулинов (1939) и тем самым обнаружена новая ф-ция белков - защитная. Важным этапом явилось открытие ферментативной ф-ции мышечного миозина (В. А. Энгельгардт, М.Н.Любимова, 1939) и получение первых кристаллич. ферментов (уреазы-Дж.Б. Салшер, 1926; пепсина - Дж.X. Нортроп, 1929; лизоцима - Э. П. Абрахам, Р. Робинсон, 1937).

В нач. 50-х гг. была выдвинута идея о трех уровнях организации белковых молекул (К. У. Линдерстрём-Ланг, 1952) - первичной, вторичной и третичной структурах. Определены первичные структуры инсулина (Ф. Сенгер, 1953) и рибонуклеазы (К. Анфинсен, С. Мур, К. Хёрс, У. Стайн, 1960). По данным рентгеноструктурного анализа были построены трехмерные модели миоглобина (Дж. Кендрю, 1958) и гемоглобина (М, Перуц, 1958) и, т. обр., доказано существование в белках вторичной и третичной структур, в т. ч.1048-3.jpg спирали, предсказанной Л. Допингом и Р. Кори в 1949-51.

В 60-е гг. в химии белков интенсивно развивалось синтетич. направление: были синтезированы инсулин (X. Цан, 1963, П. Кадоянис, 1964, Ю. Ван и др., 1965) ирибонуклеаза А (Б. Меррифидд, 1969). Дальнейшее развитие получили аналит. методы: стал широко использоваться автоматич. аминокислотный анализатор, созданный С. Муром и У. Стайном в 1958, существенно модифицированы хроматографич. методы, до высокой степени совершенства доведен рентгеноструктурный анализ, сконструирован автоматич. прибор для определения последовательности аминокислотных остатков в белках - секвенатор (П. Эдман, Г. Бэгг, 1967). Благодаря созданию прочной методич. базы стало возможным проводить широкие исследования аминокислотной последовательности белков. В эти годы была определена структура неск. сотен сравнительно небольших белков (до 300 аминокислотных остатков в одной цепи), полученных из самых разл. источников как животного, так и растит., бактериального, вирусного и др. происхождения. Среди них — протеолитич. ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин, карбоксипептидазы), миоглобины,гемоглобины, цитохромы, лизоцимы, иммуноглобулины, гистоны, нейротоксины, белки оболочек вирусов, белково-пептидные гормоны и др. В результате были созданы предпосылки для решения актуальных проблем энзимологии, иммунологии, эндокринологии и др. областей физ.-хим. биологии.

В 70-80-е гг. наиб. прогресс был достигнут при изучении белков - регуляторов матричного синтеза биополимеров (в т.ч. белков рибосом), сократительных, транспортных и защитных белков, ряда мембранных белков (в т. ч. белков биоэнергетич. систем), рецепторных белков. Большое внимание уделялось дальнейшему совершенствованию методов анализа белков. Значительно повышена чувствительность автоматич. анализа аминокислотной последовательности белков (Б. Витман-Либольд, Л. Худ). Широкое применение нашли новые методы разделения белков и пептидов (жидкостная хроматография высокого давления, биоспецифич. хроматография). В связи с разработкой эффективных методов анализа нуклеотидной последовательности ДНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сенгер) стало возможным использовать полученную при таком анализе информацию и при определении первичной структуры белков. В результате установлена структура ряда белков, доступных в ничтожно малых кол-вах (интерферон, ацетилхолиновый рецептор), а также белков большой мол. массы (фактор элонгации G, гликогенфосфорилаза,1048-4.jpgгалактозидаза, коллаген,1048-5.jpg и1048-6.jpgсубъединицы РНК-полимеразы, содержащие соотв. 701, 841, 1021, 1028, 1342 и 1407 аминокислотных остатков). Успехи структурного анализа позволили вплотную приступить к определению пространств, организации и молекулярных механизмов функционирования надмолекулярных комплексов, в т.ч. рибосом, хроматина(нуклеосом), митохондрий, фагов и вирусов. Существ, результаты получены в эти годы советскими учеными: определена первичная структурааспартатаминотрансферазы (1972), бактериородопсина (1978), животного родопсина (1982), нек-рых рибосомальных белков, фактора элонгации G (1982), важнейшего фермента-РНК-полимеразы (1976-82), нейротоксинов и др.

Строение белковых молекул. Практически все белки построены из 201048-7.jpgаминокислот, принадлежащих, за исключением глицина, к L-ряду. Аминокислоты соединены между собой пептидными связями, образованными карбоксильной и1048-8.jpgаминогруппами соседних аминокислотных остатков (см. ф-лу I): 
1048-9.jpg

Белковая молекула может состоять из одной или неск. цепей, содержащих от 50 до неск. сотен (иногда - более тысячи) аминокислотных остатков. Молекулы, содержащие менее 50 остатков, часто относят к пептидам. В состав мн. молекул входят остатки цистина, дисульфидные связи к-рых ковалентно связывают участки одной или неск. цепей.

В нативном состоянии макромолекулы белков обладают специфич. конформацией. Характерная для данного белка конформация определяется последовательностью аминокислотных остатков и стабилизируется водородными связями между пептидными и боковыми группами аминокислотных остатков, а также гидрофобными и электростатич. взаимодействиями. Большое влияние на конформацию оказывают взаимод. белков с компонентами среды (вода, липиды и др.), в к-рой они функционируют.

Различают четыре уровня организации белковых молекул. Последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи наз. первичной структурой. Все белки различаются по первичной структуре; потенциально возможное их число практически неограничено. Термин "вторичная структура" относится к типу укладки полипептидных цепей. наиб. часто встречающиеся типы-правая1048-10.jpg спираль и1048-11.jpgструктура. Первая характеризуется планарностью пептидной группы; водородные связимежду СО-и NH-группами пептидной цепи замыкают циклы из 13 атомов (рис. 1). На 1 виток1048-12.jpgспирали приходится 3,6 остатка аминокислот, шаг спирали -0,544 нм. Значительно менее энергетически выгодны правые 310- и1048-13.jpgспирали, содержащие соотв. 3 и 4,4 аминокислотных остатка на 1 виток, а также 10 и 16 атомов в циклах, образованных водородными связями. 310-Спирали встречаются сравнительно редко и образуют только очень короткие участки, к-рые обычно располагаются на концах1048-14.jpgспиралей. Предсказанные теоретически правые1048-15.jpgспирали, а также левые1048-16.jpg 310- и1048-17.jpgспирали в белках не обнаружены.

В случае1048-18.jpgструктуры, или структуры складчатого листа, полипептидные цепи растянуты, уложены параллельно друг другу и связаны между собой водородными связями. Остов цепи не лежит в одной плоскости, а вследствие небольших изгибов при1048-19.jpgуглеродных атомах образует слегка волнистый слой. Боковые группы располагаются перпендикулярно плоскости слоя. В белках обнаружены два вида1048-20.jpgструктуры: с параллельным и антипараллельным направлениями цепей (рис. 2). Частный случай1048-21.jpgструктуры-1048-22.jpgизгиб, обеспечивающий поворот пептидной цепи на угол ок. 180° на протяжении отрезка, содержащего 4 аминокислотных остатка; 1-й и 4-й остатки соединены водородной связью. Относительное содержание1048-23.jpgспиральных участков и1048-24.jpg структур может широко варьировать. Существуют белки с преобладанием1048-25.jpgспиралей (ок. 75% в миоглобине и гемоглобине), тогда как осн. тип структуры многих фибриллярных белков, в т.ч. фиброина шелка и кератина волос,-1048-26.jpgструктура. У многих белков содержание1048-27.jpg и1048-28.jpgструктурных участков незначительно, однако и в этих случаях полипептидные цепи укладываются в пространстве строго определенным, характерным для каждого белка образом.

Под третичной структурой белков понимают расположение его полипептидной цепи в пространстве. Существ. влияние на формирование третичной структуры оказывают размер, форма и полярность аминокислотных остатков. В молекулах глобулярных белков большая часть гидрофобных остатков скрыта внутри глобулы, а полярные группировки располагаются на ее пов-сти в гидратированном состоянии. Однако ситуация не всегда настолько проста. Связывание белка с др. молекулами, напр.фермента с его субстратом или коферментом, почти всегда осуществляется с помощью небольшого гидрофобного участка на пов-сти глобулы. Область контакта мембранных белков с липидами формируется преим. гидрофобными остатками. Третичная структура многих белков составляется из неск. компактных глобул, наз.доменами (рис. 3). Между собой домены обычно бывают связаны "тонкими перемычками" - вытянутыми полипептидными цепями. Пептидные связи, расположенные в этих цепях, расщепляются в первую очередь при обработке белков протеолитич. ферментами, тогда как отдельные домены м. б. достаточно устойчивы к протеолизу. 
1048-29.jpg

Рис. I. Спиральные конформации полипептидных цепей: а-310-спираль, б-1048-30.jpg спираль, в-1048-31.jpgспираль (пунктирные линии-водородные связи). 
1048-32.jpg

Рис. 2. Схематич. изображение1048-33.jpgструктур: слева - антипараллельный, справа - параллельный складчатый лист. 
1048-34.jpg

Рис. 3. Схематич. изображение трехмерной структуры малатде-гидрогеназы. Участки1048-35.jpgспиралей (от1048-36.jpg до1048-37.jpg) и1048-38.jpgструктур (от1048-39.jpg до1048-40.jpg) представлены соотв. в виде прямоугольников и прямых линий со стрелками. Структура состоит из двух отчетливо различимых глобулярных областей (доменов). Участок полипептидной цепи, соединяющий домены между собой, показан точечной линией.

Термин "четвертичная структура" относится к макромолекулам, в состав к-рых входит неск. полипептидных цепей (субъединиц), не связанных между собой ковалентно. Такая структура отражает способ объединения и расположения этих субъединиц в пространстве. Между собой отдельные субъединицы соединяются водородными, ионными, гидрофобными и др. связями. Изменение рН и ионной силы р-ра, повышение т-ры или обработка детергентами обычно приводят к диссоциациимакромолекулы на субъединицы. Этот процесс обратим: при устранении факторов, вызывающих диссоциацию, может происходить самопроизвольная реконструкция исходной четвертичной структуры. Явление носит общий характер: по принципу самосборки функционируют многие биол. структуры. Способность к самосборке свойственна и отдельным фрагментам белков - доменам. Более глубокие изменения конформации белков с нарушением третичной структуры наз. денатурацией.

Свойства. Физ.-хим. св-ва белков определяются их высокомол. природой, компактностью укладки полипептидных цепей и взаимным расположением остатковаминокислот. Мол. масса варьирует от 5 тыс. до 1 млн., а константы седиментации - от 1 до 20 (и выше). Средний уд. объем белковых молекул - 0,70-0,75 см3/г, аконстанты диффузии - 106-10см2/с. Максимум поглощения белков в УФ-области спектра, обусловленный наличием ароматич. аминокислот, находится вблизи 280 им. Возбуждение электронов атома азота пептидной группы вызывает резкое увеличение поглощения при 185-240 нм. В ИК-области спектра белки поглощают за счет СО- и NH-rpyпп при 1600 и 3100-3300 см-1.

В р-рах белки амфотерны. Изоэлектрич. точки белков могут иметь значения от < 1,0 (у пепсина) до 10,6 (у цитохрома с) и выше. Боковые группы аминокислотных остатков способны вступать во многие р-ции. Белки дают ряд цветных р-ций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или хим. группировок. К важнейшим из них относятся: биуретовая реакция (пептидные связи), ксантопротеиновая реакция (ароматич. ядра остатков тирозина, триптофана, фенилаланина),Адамкевича реакция (индольное кольцо триптофана), Мил лона реакция (фенольный радикал тирозина), Паули реакция (имидазольное кольцо гистидина), Сакагучи реакция (гуанидиновая группа аргинина) и нингидриновая реакция (аминогруппа).

Выделение. Один из первых этапов выделения белков - получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее белки переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда - неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (NH4)2SO4], этанолом, ацетоном или путем изменения рН, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4°С); с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые белки стабилизируют полиолами, напр. глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных белков или группы гомологичных белков: наиб. распространенные методы разделения-гель-проникающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография; эффективные методы-жидкостнаяхроматография высокого разрешения и аффинная хроматография.

Критерий чистоты белков - гомогенность при электрофорезе, хроматографии и ультрацентрифугировании. Одноцепочечный белок должен быть гомогенным при N- и С-концевом анализе (см. ниже). Примесь сопутствующих ферментов определяют с помощью специфич. субстратов; высокую чувствительность имеют иммунохим. методы (обычно до 10-3 мкг/мл примесного антигена).

Методы исследования первичной структуры. Знание первичной структуры белка-основа для определения его вторичной и третичной структур, выяснения расположения функц. групп в активном центре белка и построения модели его функционирования. Исследование первичной структуры мутантных белков позволяет на молекулярном уровне характеризовать различия между штаммами микроорганизмов, фагов и вирусов, выяснять молекулярные причины генетич. болезней. Данные по первичной структуре используют при установлении и проверке таксономич. взаимоотношений между разл. видами живых организмов, построении фило-генетич. древа и анализе хода биол. эволюции.

Для определения аминокислотной последовательности белка прежде всего разделяют его полипептидные цепи (если макромолекула состоит из неск. цепей). Затем определяют аминокислотный состав цепей, N- и С-концевые аминокислотные остатки и аминокислотные последовательности. Полипептидные цепи подвергают специфич. расщеплению протеолитич. ферментами или хим. реагентами. Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность. При необходимости крупные фрагменты дополнительно расщепляют к.-л. способом на более мелкие. Порядок расположения фрагментов выясняют путем расщепления молекулы белка по др. связям и анализа образующихся при этом "перекрывающихся" фрагментов.

Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого белка или пептида и количеств. определение всех аминокислот в гидролизате. Длягидролиза обычно используют 5,7 н. водный р-р НС1, а при анализе содержания триптофана - 4 н. метансульфоновую к-ту, содержащую 0,2% 3-(2-аминоэтил)индола, или кипячение со щелочью. Количеств. определение аминокислот в гидролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически по р-ции с нингидрином или флуориметрически с использованием флуорескамина или о-фталевого диальдегида. В последнем случае можно анализировать до 0,1-0,05 нмоль аминокислоты.

Наиб. распространение для определения N-концевых остатков находит дансильный метод. Его первая стадия -присоединение дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида) к непротонированной1048-41.jpgаминогруппе с образованием дансилпептида (ДНС-пептида). Затем последний гидролизуют 5,7 н. р-ром НС1 при 105 °С, в результате чего освобождается N-концевая1048-42.jpgДНС-аминокислота, к-рая обладает интенсивной флуоресценцией в УФ-области спектра; для ееидентификации достаточно 0,1-0,5 нмоля в-ва.

Для определения С-концевых остатков чаще всего используют ферментативный гидролиз карбоксипептидазами, к-рые специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-концевыми остатками. Поскольку после отщепления концевых остатков фермент атакует послед. пептидные связи, измерение скорости отщепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую аминокислотную последовательность.

Важнейший этап в определении первичной структуры белка - расщепление макромолекулы на пептидные фрагменты. Среди ферментативных методов расщепления наиб. широко используется гидролиз трипсином. Трипсин обладает уникальной субстратной специфичностью: гидролизует исключительно связи, образованныекарбоксильными группами осн. аминокислот - лизина и аргинина. Введение заместителей в боковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу по остаткам модифициров. аминокислот и позволяет гидролизовать макромолекулы избирательно только по остаткам аргинина или лизина. Особенно часто используется модификация остатков лизина с послед. гидролизом белков по остаткам аргинина. Модифицирующие агенты - ангидриды дикарбоновых к-т (янтарной, малеиновой и цитраконовой). Из др. протеолитич. ферментов широко применяется протеаза из Staphylococcus aureus (гидролизует связи, образованные карбоксильными группамиостатков глутаминовой к-ты, а в нек-рых случаях и остатков аспарагиновой к-ты), а также химотрипсин и термолизин. Последние ферменты обладают более широкойспецифичностью. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматич. аминокислот - тирозина, фенилаланина итриптофана. С меньшей скоростью гидролизуются связи лейцина, метионина и гистидина. Термолизин преим. расщепляет связи, образованные аминогруппой остатков с гидрофобной боковой цепью (изолейцин, лейцин, валин, фенилаланин, тирозин, триптофан).

Из химических методов расщепления белков наиболее специфичный и чаще всего применяемый -бромциановое расщепление по остаткам метионина (выход 90-100%): 
1048-43.jpg

Для расщепления белков по карбонильной группе остатка триптофана используют N-бромсукцинимид или более селективный 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминдол (BNPS-скатол) (выход Ю-50%): 
1048-44.jpg

Гидроксиламин расщепляет пептидные связи между остатками аспарагина и глицина. При его взаимод. с циклич. имидом ангидроаспартилглицина, спонтанно образующегося из аспарагинилглицина, в щелочной среде происходит расщепление пептидной цепи с образованием смеси1048-45.jpg и1048-46.jpgаспартилгидроксаматов: 
1048-47.jpg

В ряде случаев для расщепления белков используется метод частичного кислотного гидролиза. наиб. чувствительны к действию к-т аспартильные пептидные связи и особенно связь аспартил - пропил.

При выборе методов разделения пептидов учитывают физ.-хим. свойства, кол-во и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционирования смесей коротких пептидов, содержащих до 15-20 аминокислотных остатков, в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах. Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля.

Осн. сложность при фракционировании молекул крупных пептидов (более 20 аминокислотных остатков) - их св-во слипаться в водных р-рах друг с другом с образованием высокомол. агрегатов, не поддающихся разделению. Для предотвращения агрегации в буферные р-ры вводят мочевину (до 8 М), гуанидинийхлорид (до 6 М) или детергенты (додецилсульфат Na); разделение часто проводят с помощью гель-проникающей хроматографии и ионообменной хроматографии. Эффективныйметод разделения - жидкостная хроматография высокого разрешения на носителях с обращенной фазой. Для селективного выделения пептидов, несущих химически активные группировки, м. б. использована хемоспецифич. (ковалентная) хроматография, основанная на образовании ковалентной связи пептида с носителем. Напр., для выделения цистеинсодержащих пептидов используют р-цию тиол-дисульфидного обмена, с помощью к-рой пептиды через дисульфидный мостик присоединяются к модифицированному 2,2-дипиридилдисульфидом&nbsp носителю. Ковалентно связанные с носителем цистеинсодержащие пептиды м. б. легко элюированы при послед. обработке1048-48.jpg меркаптоэтанолом.